Informações básicas

Na biologia molecular, utilizamos o procedimento para detectarmos o gene de interesse e aumentarmos o número de cópias dele para que consigamos analisa-lo. Em um exemplo hipotético, você gostaria de estudar o gene Abcem camundongo para compará-lo com o mesmo gene só que em espécies diferentes. Por meio de pesquisas foi verificado que o camundongo tem aquele gene e que existem primersjá descritos na literatura para o gene. Com essas informações em mente precisamos iniciar os procedimentos:

• Extração de DNA do organismo de interesse
• Verificação da integridade de DNA através de gel de agarose
• Quantificação desse DNA
• Confecção de primers

Parte prática do PCR

Lembre-se que antes de iniciar o procedimento você precisa verificar se o laboratório possui todos os reagentes. 

Mantenha a bancada limpa, passe álcool em toda superfície a ser trabalhada e se possível esterilize as pipetas em luz UV.

Para iniciar a PCR tenha em mente que você está realizando um procedimento que naturalmente ocorre dentro de células vivas, por isso não esqueça de nenhum reagente, abaixo a lista

• Tampão de reação (Buffer)
• dNTP (bases nucleotídicas)
• Primer forward
• Primer reverse
• MgCl₂
• Água
• Taq polymerase
• DNA alvo

Todos esses reagentes serão adicionados em quantidades específicas para que a reação química possa acontecer da forma mais harmoniosa possível.

Vamos iniciar o PCR

Problema:Você quer amplificar o gene Abc em 5 amostras de rato e por sorte do destino o seu laboratório já possui os primers indicados para o gene, assim como possui uma amostra de capivara que já amplificou para o mesmo gene. Vamos então para o procedimento:

ps:caso você ainda não tenha os primers e nem literatura referente aos primers, ir para o post relacionado a desenho de primers

Inicie descongelando suas amostras de DNA e todos os reagentes, com EXCEÇÃO da Taq polymerase. A PCR consiste em misturar os reagentes e coloca-los junto com cada amostra, em nosso caso teremos 6 amostras (5 ratos+1 capivara), fora isso usaremos uma amostra para ser o controle negativo (livre de contaminação, sem DNA, apenas reagentes), logo precisaremos separar 7 tubos de 0.2 uL. Estes tubos devem ser identificados com o nome das amostras para posterior controle, isso é muito importante!!

Sobre os cálculos dos reagentes que normalmente chamamos de MIX, existem várias receitas aqui colocarei um exemplo:

	Quantidade (uL)	X número de amostra
Buffer	3.0
MgCl	1.2
dNTP	1.2
Primer forward	0.8
Primer reverse	0.8
H20	6.92
Taq	0.08
Volume final	14

Etapas do PCR

Após o preparo dos reagentes é necessário colocar as amostras em um equipamento chamado termociclador, esse equipamento simula a temperatura necessária para amplificar uma molécula de DNA. Para isso utilizamos diferentes temperaturas que são importantes em diferentes fases do PCR, vamos vê-las.

• Desnaturação, nessa etapa utilizamos altas temperaturas para separar as fitas-duplas do DNA
• Anelamento, aqui a temperatura é reduzida para que os primers consigam parear nas regiões específicas do DNA

Extensão, a temperatura é otimizada para a ativação da Taq polymerase

Exemplo de ciclagem utilizada:

95°C   por 30 segundos

95°C   por 5 segundos

60°C   por 30 segundos                     40 ciclos

72°C   por 30 segundos

72°C   por 30 segundos

4°C     ¥

Com mais detalhes

• Desnaturação
• Aquecimento a 94-95⁰C.
• A alta temperatura instabilidades nas ligações de hidrogênio e os dois filamentos de DNA se separam.
• Resultando em duas cadeias simples de DNA.
• É importante que a temperatura seja mantida neste estágio por tempo suficiente para garantir que os filamentos de DNA se separem completamente.
• Isso geralmente leva entre 15 a 30 segundos.
• Anelamento
• A reação é resfriada a 50-65⁰C. Isso permite que os primers se prendam a um local específico no DNA modelo de fita simples por meio de ligações de hidrogênio (a temperatura exata depende dos primers que você está usando).
• As duas cadeias separadas de DNA são complementares e correm em direções opostas (de uma extremidade – a extremidade 5 ’- para a outra – a extremidade 3’). Sendo assim, existem dois primers – um forward e um reverso.
• Este passo geralmente leva cerca de 10 a 30 segundos.
• Extensão
• Aumento de temperatura para 72 ° C permitindo que o novo DNA seja produzido por uma enzima especial Taq polimerase que adiciona bases de DNA.
• 72⁰C é a temperatura ideal para a Taq polimerase para construir a fita complementar. Ele se liga ao primer e adiciona bases de DNA ao single strand um a um na direção de 5 ‘para 3’.
• O resultado é uma nova linha de DNA e uma molécula de DNA de cadeia dupla.