Processo pré-desenho de primers

Antes de iniciar o desenho de primers é necessário verificar algumas informações básicas, como:

• Tamanho em pares de base do gene alvo
• Região codificante do gene alvo (CDS)
• Quantidade de sequências depositadas em banco de dados (ex. GenBank) e tamanho das mesmas, verificar sequências que são predicted. NOTA: Para maiores informações a respeito do que seriam predicted sequences, ver What_is_a_predicted_sequence_in_NCBI
• Trabalhos que sequenciaram esses genes e de lá extrair informações como: os primers utilizados, temperatura de anelamento dos primers

De preferência essas informações devem ser tabeladas para melhor acesso durante a realização do trabalho. Com esses dados serão tomadas decisões como: se existe a necessidade de desenhar primers, tamanho do fragmento a ser amplificado e quais genes devem ser trabalhados.

Desenho de primers

Para o desenho de primers existem inúmeras ferramentas que realizam essa tarefa, desde ferramentas on-line (ex. site1 – eurofins), programas pagos (ex. Geneious), programas livres (ex. Oligo-Analyzer, OligoExplorer). Alguns parâmetros são importantes para o desenho de primers eficientes.

Durante o desenho de primers deve-se evitar a escolha por regiões repetitivas dos genomas, como ACCCCC, ATATAT. Caso de utilize o programa OligoAnalyzer verificar a opção inter-primer homology, onde mostram regiões de ocorrência de self-dimers. Ainda sobre parâmetros que possam aparecer nesse ou em outros programas, encontra-se o dG, valor que quanto mais negativo melhor, pois significa que a reação é mais espontânea.

Outros parâmetros:

• Formação de estruturas secundárias como hairpin. Hairpin seria o anelamento com o próprio primer
• DG mensura a espontaneidade de uma reação, também indicam a estabilidade do hairpin e a energia requerida para quebrar uma estrutura secundária. Altos valores negativos indicam estabilidade, valores entre -5 e -6 podem ser considerados toleráveis
• Cross dimer quando ocorre interação entre sense e antisense

Na prática

No exemplo abaixo utilizei uma ferramenta on-line para desenho de primers, primeiramente estou utilizando uma sequência conhecida do meu gene de interesse, no exemplo uso JF703246.1 Sooglossus sechellensis POMC (pomc) gene, partial cds

Após clicar em PICK PRIMERS, o site apresenta uma tabela com possíveis primers

Nesse resultado temos poucas informações, apenas a sequência dos primers, a posição que inicia o anelamento, o tamanho do produto e o valor de TM. Em outros sites é possível ter informações mais precisas a respeito dos parâmetro, assim como nos programas.